亚洲综合激情五月丁香六月丨免费精品视频在线观看丨青青毛片丨久久久久国色av免费观看性色丨欧美又大又硬又粗bbbbb丨成人av网站免费丨a级黄色影院丨91看片黄色丨在线观看片免费人成视频播放丨午夜精品久久久久久久2023丨日韩欧美一区二区三区四区五区丨乱淫a欧美裸体超级xxxⅹ丨国产一二三四区乱码免费丨日本黄色三级丨久久69丨麻豆精品乱码一二三区别蜜臀在线丨国产亚洲网曝欧美台湾丝袜丨免费久久丨免费av在线播放丨浪潮av色综合久久天堂

（一）、儀器設備 
英國Thermo Hybaid原位PCR儀。 

（二）、操作流程 
1、原位PCR步驟 
1）預處理： 
（1）切片常規脫蠟； 
（2）0.2mol/L HCl 處理10min； 
（3）5μg/ml蛋白酶K消化組織37℃10min； 
（4）Nase消化組織 37℃ 30min； 
（5）梯度酒精脫水，室溫干燥。 
2）原位擴增： 
（1）切片滴加特異性序列引物30μLPCR擴增反應液，覆蓋硅化蓋玻片，石蠟油封邊； 
（2）PCR熱循環：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共25～30個循環，72℃延伸10min； 
（3）氯仿洗去蓋玻片，4％多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脫水，干燥。 
3) 原位雜交： 
（1）加標記探針的雜交液，98℃變性10min，-20℃退火5min，42℃雜交過夜。 
（2）雜交后用2×SSC洗滌10min，3次，1×SSC洗滌 10min，3次； 
（3）緩沖液洗滌10min，3次； 
（4）加堿性酶標記的羊抗抗體復合物，37℃，2h； 
（5）緩沖液洗滌5min，3次； 
（6）NBT、BCIP暗處顯色，鏡下控制，終止顯色。 
（7）常規脫水：透明、封固。 
2、原位RT-PCR步驟 
1）預處理： 
（1）蛋白酶 K(0.3mg/mL) 54℃消化20min，蒸餾水洗； 
（2）95℃加熱3min，滅活殘存的蛋白酶。 
2）原位擴增： 
（1）在有RNA酶抑制劑存在的條件下，用隨機六聚物進行逆轉錄反應； 
（2）用熱啟動法進行PCR擴增。標本加熱至75℃時加上反應液，覆以蓋玻片，四周用指甲油密封。然后將溫度升至95℃，2min。再將熱循環儀設定為 95℃，45s，55℃，1min和75℃，45s，共26次循環； 
（3）擴增結束后，在80℃烤15min～30min。 
3）原位雜交： 
（1）雜交前標本95℃加熱3min； 
（2）加上雜交液，濕盒內50℃過夜；雜交液組成：25％硫酸葡聚糖，2×SSC，50％甲酰胺，0.33mg/ml變性的鮭魚精子DNA， 每0．5mL雜交液內含生物素標記探針1ng。 
（3）擴增的β-肌動蛋白和IL-6用DAKO檢測試劑盒K600(鏈霉卵白素，生物素標記的堿性酶和硝基四氮唑藍)檢測。陽性反應呈紫色。 

elisa試劑盒，進口elisa試劑盒，放射免疫試劑盒，amresco，Gibco培養基-南京信帆生物技術有限公司